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蛋白质修饰分析服务

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案例解析
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送样须知
Q&A

　　蛋白质组学的研究的工作不仅聚焦于细胞不同生长时期或是疾病条件下的蛋白质表达水平变化，许多至关重要的生命进程不仅由蛋白质相对丰度控制，更重要的是被时空特异分布的、可逆的翻译后修饰所调控，因而揭示翻译后修饰发生规律是解析蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提。蛋白质发生翻译后修饰时其分子质量会发生相应的改变，顺利获得质谱能够精确测定蛋白质或多肽的分子质量。同时，发生翻译后修饰的蛋白质在样本中含量低且动态范围广，所以在质谱检测前需要对发生修饰的蛋白质或肽段进行富集。

　　蛋白质酶解成肽段后，对肽段进行TMT标记，然后使用蛋白质修饰类泛抗体或生物材料对相应的修饰肽段进行高选择性富集，最后使用高分辨率质谱完成样本的定量分析。

磷酸化蛋白质组学研究流程

　　

修饰类型：磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化等。

 

　　使用仪器：THERMO: Orbitrap Eclipse、Orbitrap Exploris 480、Q Exactive plus高分辨质谱。

 

　　技术优势：可平行比较2-10个样本中各类修饰的相对丰度；使用高质量的修饰泛抗体和高选择性的生物富集材料，修饰的鉴定通量高；可用于各种类型样本。

 

　　应用领域： 疾病机理研究，个性化医疗，农业品种改良。

 

　　样品要求：

样品类型

样品要求（/组样品）

蛋白质提取物

浓度 >1μg/μl，蛋白质总量 >600μg

细胞样品

细胞量>107

组织样品

动物、微生物组织湿重>20mg；植物鲜嫩组织>200mg

体液样品

血液体积>1ml

 

　　项目周期：

进展

时间周期

收样/质控

1-2个工作日

样品处理

4-5个工作日

质谱上机

2-3个工作日

数据分析

2-3个工作日

总计

不超过20个工作日

备注：超过4个样本每增加1个增加5个工作日，如需加急请联系我方协商处理。

 

　　项目优势

　　a.先进的仪器：拥有THERMO Orbitrap Exploris 480、THERMO QE plus、THERMO Orbitrap Eclipse等高分辨液质联用系统，该系统具有高分辨率、高扫描速度、高质量精度的优点。

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THERMO Orbitrap Exploris 480
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THERMO QE plus
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THERMO Orbitrap Eclipse

　　

b.专业的技术团队：为您给予蛋白质定性分析、蛋白质定量分析及蛋白质修饰分析等全方位的蛋白质组学相关服务，稳定的实验方案，严格的质控标准，保证您的实验达到最优效果。

　　c.个性化的服务：拥有专业的生物信息团队和大型计算机，可以为合作伙伴给予个性化的生物信息分析服务。

　　d.完善的售后服务：从报告解读至文章发表，武汉生物PA视讯zhenren官网有限公司可全程给予高效高质量的服务。

　　案例一  沙门氏菌中PhoP依赖于酪氨酸磷酸化的降解机制

　　项目简介

　　研究材料用的是一种革兰氏阴性菌。细菌中有一类非常著名的感应外界信号并作出应答的系统，被称为二元调控系统。二元调控系统信号传导的基础是蛋白磷酸化。以其中最关键的PhoP/PhoQ系统为例，细胞膜上的感应蛋白PhoQ感受外界信号的刺激，发生自磷酸化，接着将磷酸根转移至调节蛋白PhoP上的特定天冬氨酸位点上，从而激活它。磷酸化的PhoP就可以调控下游一系列基因的表达，包括很多与细菌致病与毒力相关的基因。

 

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PhoP/PhoQ调节系统示意图

 

　　项目流程

　　a.磷酸化位点的鉴定

　　为了鉴定PhoP蛋白上其他可能的磷酸化位点，第一时间IP纯化了过表达的PhoP,然后胶内酶解为肽段，顺利获得质谱分析，发现PhoP上的一个酪氨酸磷酸化位点。这张二级质谱图包含丰富的碎片离子和酪氨酸磷酸化的特征亚胺离子(216.043)，确定了该磷酸化位点。

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PhoP磷酸化位点的鉴定

 

　　b.双甲基化定量分析

　　利用基于双甲基化的定量蛋白质组学技术研究这个酪氨酸磷酸化对细菌的蛋白质组产生了哪些影响。典型的定量蛋白质组学的流程：培养野生型CmP菌株、模拟磷酸化的YD突变株、模拟非磷酸化的YF突变株，然后提取蛋白，酶解为肽段，双甲基化标记分别标记为轻中重，等比混合后，进行质谱检测和定量分析。

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双甲基化定量分析

 

　　c.结果分析

　　在两组生物学重复中，共同定量到了约1600个蛋白，其中上调的有200个，下调的有274个。相关性分析表明，两次之间的重复性很好。

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数据概述

 

　　把文献中已报道的PhoP激活的蛋白的定量信息提取出来，做了这样一个热图(如下图)，可以看出他们都在模拟磷酸化的菌株中显著下调了，而在模拟非磷酸化的YF菌株中基本没有变化。

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已知的PhoP激活的蛋白

 

　　在检测PhoP和PhoQ蛋白水平和mRNA水平上的变化时，发现模拟磷酸化的Y到D突变后，PhoP在蛋白水平降低的程度远远大于PhoQ，而在mRNA水平上，两者的变化差别不大。

　　顺利获得体内蛋白的降解实验发现，PhoP在YD突变后，蛋白发生了降解。由下图可以看到，随着时间的变化，只有模拟磷酸化的YD突变发生了降解，而野生型PhoP、模拟非磷酸化的YF突变，以及同样会造成PhoP蛋白失活的D52A突变，都没有降解现象发生。

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体内蛋白的降解实验

 

　　有功能的PhoP对细菌在抗病菌多肽环境中的生长和生存至关重要。从这个实验可以看出，模拟磷酸化的YD突变和PhoP失活的PhoP-菌株一样，对抗病菌肽的抵抗能力显著下降。

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图 抗病菌肽抵抗实验

 

　　d.研究结论

　　最后是一个简单的模式图，作为对以上这些发现的总结。当PhoP上已知的经典的D52被PhoQ磷酸化时，PhoP被激活而发挥重要的调控作用。而当这个Y位点被某个激酶磷酸化时，PhoP则会被降解掉，从而失去调控活性。

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PhoP降解模式图

持续更新中，敬请期待...

　　1.蛋白质组学项目服务流程

 

　　2.蛋白质组学样品准备的一般原则

　　a)确保样品状态良好，符合预期的表型或分子指标。

　　b)带手套、口罩、头套进行操作，避免角蛋白污染。

　　c)保证取材后的操作在冰上进行，并尽量操作迅速。

　　d)依后续实验需求，实行分装，避免蛋白反复冻融。

　　e)取材后，液氮速冻，- 80 ℃ 冰箱保存，干冰寄送。

 

　　3.蛋白质组学服务项目对样品量的要求

样本类别

样本规格

银染或考染胶条

需条带肉眼清晰可见

细胞

蛋白质组学项目需1×106或体积>30 μL；磷酸化蛋白质组学项目需1×107

动物组织

蛋白质组学项目需鲜重100 mg；磷酸化蛋白质组学项目需500 mg

植物组织

蛋白质组学项目需鲜重200 mg；磷酸化蛋白质组学项目需1 g

备注：对于蛋白得率较低的样品，建议在条件允许的情况下，适当提高样品送样量；特殊样品，请联系公司技术人员协商送样量。

 

　　4.蛋白质组学服务项目样本寄送指南

样本类型

样本寄送要求

胶条样品

将蛋白条带用干净的刀片切下，并切割为1 mm3的小块，装入进口EP管中及时送样，送样时需加冰袋维持低温。

细胞、细菌样品

需用预冷的PBS缓冲液清洗三次，以去除培养基的成分，清洗结束后，离心将上清弃去，液氮速冻后，干冰寄送。

动物组织样品

取材后冰上操作，迅速将组织剪成0.5 mm3的小块，用预冷的PBS清洗三遍，去除残余的血液，称重后，液氮速冻，干冰寄送。

植物组织样品

取材后，用预冷的PBS将材料表面的污物去除，称重后，液氮速冻，干冰寄送。

蛋白溶液样品

最好测定蛋白浓度后，干冰寄送冻存的蛋白溶液（需指明缓冲液成分和浓度）；或者将蛋白顺利获得丙酮法沉淀下来，晾干后，干冰或冰袋寄送蛋白沉淀。

培养基上清

培养细胞至合适密度，用无血清培养基清洗三遍后，加入无血清培养基继续培养合适时间，收集培养上清，离心去除细胞后，使用0.22 μm的滤膜过滤，液氮速冻，干冰寄送。

血液样品

血液样品一定避免溶血，要求采集血液时同时制备为血清或者血浆样品，建议使用相应的采血管，之后顺利获得离心的方式取得血清或血浆，按需求分装后，液氮速冻，-80℃冰箱保存，干冰寄送。

磷酸化样品

用于磷酸化分析的样品，处理样品过程中保持低温，裂解液中需添加蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂。

持续更新中，敬请期待...

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